Aplikasi Metabolomik Dan Metabolomik untuk Standarisasi Herbal

Metabolomik adalah proses penentuan metabolit sekunder atau mikromolekul BM antara 50-5000. Sinonim dari metabolomik adalah metabolite profiling atau penentuan metabolit-metabolit dengan  karakter tertentu terkait dengan penyakit, respon pengobatan, metabolism obat, perlakuan kimiawi dll. Dikarenakan ketidakmungkinan “memotret” semua komponen dalam satu waktu, jadi senyawa-senyawa yang dipentingkan saja. Dewasa ini metabolomik dikembangkan kea rah analisis kuantitatif metabolit sekunder total yang berperan dalam aktivitas biologis-farmakologis tertentu dalam suatu sampel obat herbal yang disebut metabonomics.

            Analisis metabolomik tidak membutuhkan preparasi yang rumit, sampel yang dibutuhkan sangat kecil, kurang dari 0,1 gram atau bahkan cukup 1 mg, hasil lebih objektif karena menghindari berbagai partisi berkali-kali dan secepat mungkin sampel dianalisis sehingga sangat menguntungkan.

            Metabolomik adalah profiling (analisis kualitatif) senyawa-senyawa yang ada di dalam urin pasien penderita penyakit tertentu setelah pemberian obat. Pada proses analisis metabolomik terdapat beberapa masalah yang kerap di temui, antara lain :

1.      Pentingnya database yang akurat

2.      Penentuan metode penyarian yang efisien dan menarik semua senyawa dan terkait dengan aktivitas farmakologi.

3.      Pemisahan metabolit yang terkandung dalam sampel.

4.      Metode deteksi terpilih yang tepat.

5.      Identifikasi dan kuantifikasi analit yang tepat.

6.      Analisis statistic yang sesuai untuk menggambarkan komponen-komponen dalam ekstrak yang berperan.

Pentingnya Database

            Analisis metabolomik sangat ditentukan oleh keakuratan pengetahuan kita terhadap berbagai senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam tanaman yang hendak dianalisis.

            Pengumpulan data berbasis kemotaksonomi juga bisa dilakukan untuk melengkapi data yang ada karena seringkali banyak senyawa terkait. Konfirmasi senyawa/pemastian senyawa bisa dilakukan dengan detektor yang tepat. Dengan demikian analisis metabolomik juga bisa digunakan untuk penentuan kandungan senyawa kimia tanpa melakukan isolasi.

Metode analisis dan detekksi yang tepat

            Metabolomik bagaikan proses memotret keberadaan berbagai objek dalam suatu target sehingga berbagai senyawa yang ada disitu dari yang pendek-tinggi, gemuk-kurus, harus terekam secara Accurate (teliti) dan Precise (tepat). Maka harus di pilih metode instrumentasi yang sesuai kriteria sensitivitas dan selektivitas dan dapat mengakomodasi dan deteksi berbagai senyawa dengan ranger BM rendah ke tinggi sesuai dengan tujuan analisis.

            Analisis metabolomik harus dipastikan senyawa kimia yang ada di dalam tanaman, organ, herba, bahkan jaringan objek analisis. Maka BM (Berat Molekul) harus bisa diungkap oleh metode terpilih itu.        Pengetahuan tentang berat molekul tidak cukup karena beberapa senyawa memiliki BM yang sama, maka analisis yang kita pilih selain dapat menggambarkan BM juga harus dapat memberikan gambaran strukturnya. Dan analisis Mass spectroscopy paling sesuai untuk tujuan ini karena deteksi ini akan memberikan pola fragmentasi, sehingga dapat mengkonstruksi suatu molekul berdasarkan fragmen yang terdeteksi. Dan analisis lain yang reliable adalah NMR (Nuclear Magnetic Resonance) karena senyawa apapun akan memiliki geseran kimia (Chemical Shift) yang khas tidak memiliki oleh senyawa lain, seperti sidik jari pada manusia.

            Untuk analisis metabolomik yang paling memenuhi syarat ketentuan maka metode tandem/hyphenated method yang memenuhi ketentuan seperti GC-MS, LC-MS, dan NMR.

Metabolomik berbasis GC-MS

            Keunggulan metode ini adalah resolusi yang sangat baik dan mudah dilakukan pemisahan antar komponen, sampel yang dibuthkan hanya kurang dari 10 µl. objek untuk metabolomik berbasis GC-MS adalah senyawa volatile atau derivate yang fase diam untuk kolom GC untuk analisis metabolomik adalah yang terlapisi dari fenil 5 % dan siloksan 95 % (Fancy and Rumpel, 2008).

            Keunggulan dari metode GC-MS adalah resolusi yang sangat baik dari komponen senyawa dalam analit. Metode ini sangat baik untuk melakukan riset aspek farmakologi yang terkait komponen terpenoid dan beberapa fenil propanoid missal, aromaterapi, komponen herbal yang terkait obat syaraf.

            Untuk melakukan analisis ini sampel ditimbang beberapa mg kemudian dilarutkan kedalam solven yang cukup volatile. Untuk analisis mutu minyak atsiri harus dilakukan ekstraksi terlebih dahulu melalui destilasi terlebih dahulu.

Metabolomik berbasis LC-MS

            Metode LC-MS memiliki ring kadar yang lebih lebar dibandingkan GC-MS, dan mencakup hampir semua golongan metabolit sekunder. Untuk analisis metabolit mikromolekul dibutuhkan system terbalik yakni fase diam nonpolar. Adapun fase gerak umumnya yakni fase gerak polar : air, asetonitril, methanol, pengasaman dengan asam formiat dan asam fosfat untuk menaikkan pemisahan.

            Informasi yang diperoleh seperti GC-MS yakni puncak-puncak dengan luas area tertentu beserta Rt dan BM informasi fragmentasi. Keuntungan dari metode LC-MS adalah luas jumlah sampel yang sangat kecil dan cukup dilarutkan dalam solven organic tertentu.

            Optimasi pemisahan yang terbaik adalah pekerjaan paling awaldari system ini, sehingga fase diam isokratik sangatlah tidak cukup apalagi kita tahu terdapat puluhan bahkan ratusan senyawa di dalam suatu sampel obat herbal. Ini bisa ditanggulangi dengan mengoperasikan LC dengan kombinasi system gradient-isokratik-gradien dan seterusnya seringkali dilakukan sehingga setiap komponen akan keluar dari kolom saling terpisah dan masuk ke MS model klasik cukup memungkinkan diakukan system ini sehingga pengoperasian yang optimal sangatlah menentukan keakuratan data yang diperoleh.

Metabolomik berbasis NMR

            Chemical shift adalah suatu senyawa kimia yang khas dan tidak bisa disamai oleh senyawa lain. Senyawa apapun yang terekam geseran kimia antara 0-15 ppm bisa kita identifikasi tanpa melakukan pemurnian cukup melihat geseran kimia yang terekam dan kadang NMR dua dimensi dilibatkan untuk lebih mempertajam interpretasi. Kemudian disamakan antara senyawa-senyawa didalam database dengan berbagai nilai geseran kimia yang kita peroleh. Biasanya dalam analisis ini chemical shift H1 dan C13 yang digunakan untuk analisis ini. Sedangkan konstanta kopling hanya untuk H1.

            Kelemahan metabolomik basis NMR adalah adanya deteksi (Limit Of Detection, LOD) yang rendah biasanya sekitar 0,5 mg. untuk itu preparasi sedemikian sehingga mampu menarik berbagai komponen penting dengan jumlah yang cukup memenuhi batas deteksi.

Metabolomik berbasis elektroforesis kapiler-MS

            Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan sifat elektrik dari analit. Senyawa dengan BM besar biasanya akan lebih lambat bergerak sehingga timbulpemisahan diantara senyawa dalam analit kemudian dengan kopling spekstroskopi massa akan bisa ditentukan senyawa-senyawa yang terpisah berdasarkan BM dan pola fragmentasi. Hingga kini analisis metabolomik elektroforesis sangat terbatas dan tidak banyak laporan penelitian yang terkait.

Kini terdapat beberapa database metabolomik berbasis MS dan NMR

            BioMagResBank (BMRB) terdiri dari 270 spektra berbasis NMR. Madison Consortium Database (MCD) menyediakan data NMR dan MS dari 10.000 metabolit massBank.jp dan Golm Metabolome Database (GMD) spesifik untuk tanaman dan memfokuskan GC-MS.

Penyari yang sesuai

            Penyari yang kita gunakan harus mampu menarik semua senyawa metabolit sekunder atau sebanyak mungkin senyawa. Studi bioaktivitas harus sejalan dengan proses ekstraksi secara komprehensif dengan melibatkan  berbagai penyari sehingga bisa ditentukan solven yang paling baik untuk menyari komponen aktif terkait aktivitas farmakologis. Penyari yang digunakan memprioritaskan aktivitas.

            Untuk HPLC, GC, elektroforesis solven-solven organic lazin digunakan, untuk metabolomik berbasis NMR diperlukan solven terdeutronasi sehingga spectra yang dihasilkan hanya merepresentasikan senyawa-senyawa yang ada dan tidak terganggu spectra hydrogen/karbon dari solven yang meruah. Meskipun unsure proton (H) diganti oleh deuteron (H2) daya ekstraksi solven-solven bisa dikatakan sama.

Era penyari etanol sudah berakhir?

Meskipun etanol adalah pelarut yang dikenal universal dan mampu mengekstraksi mulai senyawa non-polar hingga senyawa polar namun extractability (kemampuan menyari) etanol tentu terbatas jika dikaitkan dosis atau senyawa target pada golongan metabolit tertentu yang bertanggung jawab terhadap aktivitas. Jika dipaksakan sedangkan kemapuan menarik senyawa golongan tertentu terbatas tentu saja akan berpengaruh pada kadar ekstrak dalam sediaan, artinya bentuk sediaan jauh lebih besar secara bobot tentu ini tidak efisien secara teknologi farmasetika.

            Studi farmakologis dari suatu obatherbal kini tak lagi perlu membatasi solven etanol tapi harus dengan pertimbangan logic-accuntable harus mengaitkan penyari yang optimal untuk tujuan aktivitas tertentu. Sedangkan residu solven yang cukup toksik atau tidak mudahnya pelarut diuapkan seperti penyari berair bisa ditanggulangi dengan berbagai alat modern saat ini seperti pengering vakum, freeze, dryer, freeze bulk dryer atau bahkan cukup penangas air modifikasi yang menghasilkan temperatur rendah. Residu solven bisa dipastikan dengan alat-alat analisis maju yakni HPLC, atau GC. Dengan demikian solven etanol tetap bisa digunakan dan bukan berarti tidak bisa digunakan sama sekali selama memberikan ekstratibilitas yang memuaskan sesuai dengan tujuan analisis.

Proses Data

Analisis statistic multivariate

            Dalam metabolomik diperlukan metode statistic yang mengkover ratusan-ribuan data. Informasi nilai chemical shift, berat molekul tertentu (BM) dan intensitas puncak tidak bermakna jika tidak dilakukan integrasi dengan data lain dan sangat sulit jika menganalisis perbedaan antarsampel dengan mengobservasi range data dan perdata. Untuk itu statistic harus dilibatkan.

            Statistik multivariate yang sering digunakan adalah PCA (Principal Component Analysis) yang menghasilkan luaran pemisahan data tanpa supervise namun langsung karena sampel masing-masing. Kemudian dilanjutkan dengan metode supervise PLS (Partial Least Square) yang akan memperlihatkan kontribusi dari komponen dalam sampel (senyawa).

Kesimpulan

Dengan aplikasi metabolomik justru ketersediaan marker tertentu di pasaran bukanlah menjadi kendala karena dengan melihat pola dan sidik jari senyawa-senyawa tertentu berbasis MS kita bisa tentukan senyawa-senyawa penanda bahkan dengan instrument tertentu langsung bisa ditentukan secara kuantitatif (metabonomik).