Isolasi dan Kloning Gen sebuah inulinase dari Bakteri Endofit

ABSTRAK

Dalam studi ini, sebuah bakteri endofit diisolasi dari Black tanaman scutellarioides Solenostemon dan diberi nama sebagai A5. Sebuah metode sederhana dan cepat digambarkan untuk mendeteksi inulinase penghasil endofit bakteri pada medium agar yang menggunakan zat warna azo Remazol Brilliant Blue-inulin sebagai substrat. Aktivitas inulinase isolat bakteri A5 terdeteksi oleh sekeliling zona bening koloni. Gen inulinase diperoleh dari bakteri A5 diamplifikasi oleh reaksi berantai polimerase. Degenerasi primer digunakan khusus dirancang untuk mengambil gen inulinase. pGEM-T Easy dan E. coli JM109 digunakan sebagai strain vektor kloning dan tuan rumah, masing-masing. Hasil penelitian menunjukkan bahwa urutan parsial gen inulinase terdiri dari 449bp. Dari perbandingan dengan urutan asam amino parsial inulinase, polipeptida disimpulkan menunjukkan kesamaan urutan tinggi untuk Paenibaccillus polymyxa dan Geobacillus stearothermophilus exo-inulinases.

PENDAHULUAN

Endofitik, menurut definisi, adalah organisme termasuk bakteri yang hidup dalam hubungan erat dengan jaringan tanaman hidup. Bakteri endofit telah ditemukan di hampir setiap pabrik dipelajari dan dapat membentuk berbagai hubungan yang berbeda termasuk simbiosis, mutualistik, komensalitik dan trophobiotic. Bakteri endofit dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman dan dapat bertindak sebagai agen biokontrol. Endofitik juga dapat bermanfaat bagi tuan rumah mereka dengan memproduksi berbagai produk alami yang bisa dimanfaatkan untuk digunakan potensial dalam kedokteran, pertanian atau industri. Beberapa bakteri endofit telah menjadi laporan inulin degraders untuk menghasilkan oligosakarida fruktosa atau lainnya.

Inulin adalah polyfructan luas dengan rantai linier â-(261)-terkait residu fruktosa melekat pada molekul sukrosa terminal. Inulin terjadi sebagai karbohidrat cadangan pada tanaman seperti sawi putih, Yerusalem artichoke, asparagus dan dahlia. Depolimerisasi dari inulin melibatkan aksi enzim yaitu inulinase. Mereka dapat dibagi menjadi exo-inulinases dan endo-inulinase [3]. Endo-inulinase menghidrolisis inulin melalui endo-reaksi (belahan dada dari dalam) memproduksi fructo-oligosakarida. Exoinulinase, seperti namanya, adalah exo-actings, yang memisahkan diri unit fruktosa terminal berturut-turut dari non-pereduksi ujung molekul inulin.

Inulinase telah diisolasi dari mikroorganisme termasuk bakteri. Pengkodean gen untuk inulinase juga telah diklon dari Aspergillus niger, A. awamori, Geobacillus stearothermophilus KP1289 [15], Arthrobacter sp, dan Kluyveromyces marxianus. Inulinase dari mikroorganisme memiliki aplikasi potensial dalam mengurangi biaya produksi dan meningkatkan kualitas sirup. Dalam studi ini, kami menggambarkan isolasi gen dari bakteri endofit inulinase, terisolasi dari scutellarioides Hitam Solenostemon. Aktivitas inulinase diuji menggunakan pewarna-coupled teknik.

Primer merosot hulu dan hilir digunakan khusus dirancang untuk mengambil gen inulinase. Di sini kita juga menunjukkan bahwa urutan gen inulinase parsial berhasil dikloning pada E. coli.

BAHAN DAN METODE

kimia:
Semua bahan kimia yang dibeli dari Sigma Chemical Co, Missouri Amerika Serikat, kecuali dinyatakan lain.

Isolasi Bakteri Endofit:

Pada awalnya tanaman scutellarioides Hitam Solenostemon atau secara lokal nama Hati-Hati Hitam dikumpulkan pada Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia, Selangor, Malaysia. Tanaman dicuci dengan air keran. Stem (1 cm) tanaman dipisahkan dan mengalami perlakuan permukaan sterilisasi untuk menghilangkan mikroflora mencemari. Sterilisasi dilakukan dalam steril 6-baik piring kultur jaringan (costar) dengan cara merendam dalam 75% (v / v) etanol selama 1 menit, 0,5% larutan natrium hipoklorit selama 5 menit dan 75% (v / v) etanol selama 1 menit . Setelah itu, batang tanaman dicuci dalam air suling diautoklaf lembut dan direndam dalam kertas tisu diautoklaf. Jaringan tanaman yang aseptik ditempatkan dalam cawan petri steril dan dibiarkan kering di udara aliran laminar. Segmen yang dibelah dua dan menggoda sepanjang panjangnya dengan jarum halus untuk mengekspos jaringan tanaman. Setiap segmen ditempatkan pada media agar nutrisi. Pelat dengan jaringan tanaman diinkubasi pada 28 º C selama 1 sampai 3 minggu untuk memungkinkan bakteri endofit untuk tumbuh. Koloni ditangkap dan kemudian dimurnikan oleh satu koloni goresan di piring NA. Bakteri Isolat ditunjuk sebagai A5.

Penapisan endofitik Inulin Merendahkan:

·         Dye-label Substrat Sintesis:
Secara singkat, 5,0 g 0,625 g inulin dan zat warna azo Remazol Brilliant Blue (RBB) dilarutkan secara terpisah di dua termos, masing-masing 62,5 ml mengandung air suling dan kemudian dicampur bersama-sama. Campuran tersebut kemudian dipanaskan pada 50 º C selama 1 jam dan pada waktu yang berbeda, bagian yang sama dari Na2SO4 (jumlah total 12,5 g) ditambahkan mengaduk campuran penuh semangat. Kemudian, 6,25 ml Na3PO4 solusi yang ditambahkan ke dalam campuran reaksi dan dipertahankan pada 50 º C selama satu jam lagi. Campuran yang dihasilkan disentrifugasi pada 5.000 g (Sigma 3k30 B. Braun) selama 25 menit pada 5 º C dan supernatan dibuang. Endapan resuspended dalam 6,25 ml air suling. Kemudian, 62,0 ml etanol 95% ditambahkan dan suspensi disentrifugasi seperti dijelaskan di atas. Prosedur ini diulang 5 kali untuk mendapatkan supernatan berwarna. Setelah itu, endapan adalah resuspended dalam etanol dan dikeringkan pada suhu kamar.

·         Deteksi RBB-inulin Bakteri Pendegradasi Isolat A5:
Yang terisolasi bakteri endofit A5 diinokulasi ke RBB-inulin dengan komposisi berikut: 1.8 g agar, 1.2 g RBB-inulin, 0.24 g

4 3 2 4 4 2 NH NO , 0.06 g KH PO , 0.06 g MgSO . 7H O, 0.06

4 2 g KCl, 0.001 g FeSO . 7H O and 0.024 g (BENERIN SENDIRI ) ekstrak ragi dan per 120 ml air suling.  Para RBBinulin dengan bakteri endofit aktif tumbuh A5 mengisolasi kemudian diinkubasi pada 28 º C selama 24 jam. Hasil positif menunjukkan zona bening di sekitar koloni bakteri.

·         Isolasi dan Manipulasi Asam Nukleat dari A5 Isolat:
Sebuah inulinase A5 menghasilkan awalnya diisolasi dari scutellarioides Hitam Solenostemon. A5 bakteri ditumbuhkan dalam kaldu nutrisi (NB). DNA genom organisme ini diekstraksi dengan menggunakan Wizard Genomic ® DNA Pemurnian (Promega, Madison, USA). Konsentrasi DNA genomik diekstraksi diperkirakan spektrofotometri menggunakan spektrofotometer UV / Visible.

·         PCR dan Amplifikasi DNA Sequencing Gene inulinase ":
DNA genom diamplifikasi dengan polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer degenerate hulu Inu F2: 5 '- TGGATGAAYGAYCCIAAYGGICTIG-3' dan primer hilir Inu R2: 5 '- RAAIACYTTIGGRTCYCTRAARTC-3' khusus
dirancang untuk mengambil gen inulinase. Primer-primer yang dirancang sesuai dengan domain yang sangat lestari dari protein inulinase bakteri. Sistem reaksi PCR terdiri dari 2,5 ml bufer PCR 2 (10X), 1,5 ml MgCl (25mm), 0,5 ml campuran dNTP (10 mM masing-masing dATP, dCTP, dGTP dan dTTP), 1,0 ml InuF2 Forward dan InuR2 Lookup (15 M) primer masing-masing, 0,25 ml Taq DNA polimerase (5 U / ml), 1,0 ml cetakan DNA (1 mg / ml) dan air suling yang disusun sampai dengan volume akhir 25 ml. Amplifikasi dilakukan dalam PCR Thermal Cycler (MJ penelitian, Inc PTC-100) dengan parameter berikut: 1 siklus pada 94 º C selama 2 menit, 35 siklus amplifikasi dari 1 menit pada 94 º C, 1 menit pada 45 º C, 1 menit pada 72 º C dan periode perpanjangan tambahan dari 3 menit pada 72 º C. Produk PCR dideteksi dengan menggunakan elektroforesis gel 1,2% (b / v) agarosa. Elektroforesis ini dilakukan pada 80 volt selama 45 menit. Kemudian, produk PCR dipotong dari gel dan dimurnikan menggunakan Wisaya ® SV Gel dan PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA).

·         Persiapan E. coli JM109 Sel Kompeten:
Kompeten E. coli sel disusun dengan menggunakan 2 metode CaCl menurut Sambrook et al. (12) dengan sedikit modifikasi. Sel E. coli JM109 dari yang disebar pada LB (1,0 g tryptone, 0,5 g ekstrak ragi, dalam 100 ml air suling) media semalam. Sebuah tunggal
koloni diinokulasikan ke dalam 50 ml SOC menengah dan diinkubasi pada 37 º C selama 3 sampai 4 jam dengan 660 kuat gemetar sampai absorbansi (nm A) mencapai 0,4-0,8. Kultur dingin dengan menyimpan tabung di atas es selama 10 menit sebelum sentrifugasi pada 1.157 xg selama 15 menit pada 4 º C untuk memulihkan sel. Setelah media dibuang, sel pelet resuspended 2 dalam 10 ml es berpendingin 0,1 M CaCl dan disimpan di atas es selama 10 menit pada 4 º C. Sel-sel itu ditemukan dengan sentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4 º C dan pelet kemudian resuspended dalam 2 ml es didinginkan 2 0,1 M larutan CaCl. Aliquot dari sekitar 200 ml dari lls ce kompeten kita sedang dibagikan ke tabung microcentrifuge dan dapat digunakan segera. Gliserol es berpendingin steril ditambahkan ke sel dan disimpan pada -80 º C untuk penggunaan masa depan.

·         Ligasi dan Transformasi Gene ke Plasmid:
Hasil pemurnian produk PCR diligasi ke dalam plasmid pGEM ®-T Easy Vector (Promega, Madison, USA) dan ditransformasikan ke dalam E. coli JM109. Koloni dari transformasi yang berhasil dijemput dan tumbuh.

·         Clone Analisis dengan PCR:
Dari LB / ampisilin / IPTG / X-Gal piring, koloni tunggal dengan vektor rekombinan diubah ditangkap dan resuspended dalam 30 ml dari campuran PCR. Campuran reaksi diinkubasi selama 5 menit, pada 94 º C untuk melisiskan sel dan menonaktifkan nucleases. Amplifikasi dari 35 siklus melalui PCR dengan kondisi seperti tersebut di atas dilakukan dan PCR produk divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa. DNA plasmid diisolasi dari gen inulinase kemudian diserahkan untuk sequencing (Pertama BERBASIS Laboratorium Sdn. Bhd). Urutan dibandingkan dengan database yang tersedia di Pusat Nasional untuk Biotechnology Information (NCBI) menggunakan program BLAST.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A5 Isolat dan Inulin-merendahkan endofit:
Sebuah bakteri endofit tak dikenal telah berhasil diisolasi dari scutellarioides Hitam Solenostemon dan diberi nama sebagai A5 dalam penelitian ini. Aktivitas inulinase bakteri A5 mengisolasi diuji menggunakan pewarna-coupled teknik [2]. Inulin kovalen terkait dengan RBB dipersiapkan sebagai substrat. Hidrolisis mikroba terdeteksi pada plate agar RBBinulin oleh zona bening (Diameter 1,2 cm) sekitar koloni bakteri A5 mengisolasi.

Inulinase Gene dari A5 Bakteri:
DNA genom diisolasi dari bakteri endofit A5 digunakan untuk PCR (Gambar 1). Sebuah band yang menunjukkan sebuah fragmen sekitar 0,4 kb dalam ukuran ditunjukkan dengan elektroforesis gel agarosa (Gambar 2). Band ini diklon dan diurutkan setelah pemulihan dan pemurnian. Urutan memproduksi keberpihakan yang signifikan dengan A5 bakteri disajikan pada Table1.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa urutan parsial gen inulinase terdiri dari 449 bp (Gambar 3). Dari perbandingan dengan urutan asam amino parsial (Gambar 4) dari inulinase, polipeptida disimpulkan menunjukkan 68% dan identitas 66% dengan yang Paenibacillus polymyxa [6] dan Geobacillus stearothermophilus (15) exo-inulinases, masing-masing.

A5 bakteri endofit juga menunjukkan derajat signifikan identitas dengan yang Pseudomonas mucidolens (66%) exo-inulinase (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa fragmen 449 bp dari urutan gen inulinase parsial dari bakteri endofit A5
berhasil dikloning pada E. coli.

kesimpulan
Amplifikasi Keberhasilan urutan gen inulinase parsial dicapai dari bakteri endofit A5. Produk amplifikasi dikloning ke dalam E. coli. Hasil ini akan membantu untuk mempelajari regulasi ekspresi gen inulinase dalam bakteri endofit di masa depan.